برترین کاربران هفتگی این مقاله

از ۱۳۹۷/۰۷/۲۸ تا ۱۳۹۷/۰۸/۰۴

هیچ کاربری در این بازه زمانی وجود ندارد

آمار مقاله
  • بازدید کل ۸۹
  • بازدید این ماه ۵۲
  • بازدید امروز ۲
آمار آزمون مقاله
  • کل شرکت کنندگان ۰
  • قبول شدگان ۰
  • شرکت کنندگان یکتا ۰
  • میانگین درصد شرکت کنندگان ۰
واژه نامه فناوری نانو

نانو

nano

پيشوندي به معناي يک بيليونم يا (000،000،000،1/1). در متون فناوري‌نانو، معمولا براي مشخص کردن يک واحد اندازه‌گيري برابر با 10 به توان منفي 9 متر استفاده مي‌شود.

سطح مقاله

پیشرفته 2

نویسندگان
کلمات کلیدی
امتیاز کاربران

نانوزیست حسگرها (5): زیست حسگرهای نوری بر پایه تشدید پلاسمون‌های سطحی

اسپکتروسکوپی بر پایه رزونانس پلاسمون‌های سطحی (SPR:Surface Plasmon Resonance) به عنوان روشی قدرتمند و بی نیاز از برچسب [Label-Free] برای بررسی برهمکنش‌های مولکولی غیرکووالانسی در زمان واقعی [Real-time] و به صورت غیر تهاجمی [Non- invasive] به کار می‌رود. تشدید پلاسمون سطحی، به عنوان یک روش بدون برچسب، برای دستیابی به سیگنال، نیازی به برچسب رنگ یا مواد خاص ندارد. در دو دهه گذشته SPR به طور گسترده در مطالعه برهمکنش‌های غیر کووالانسی پروتئین-DNA، پروتئین-سلول، DNA-RNA، DNA-DNA، پروتئین-پروتئین و... استفاده شده است. طیف سنجی تشدید پلاسمون‌های سطحی می‌تواند در تعیین سینتیک واکنش و غلظت مولکول‌های موجود در نمونه برای واکنش‌های اختصاصی به کار رود. در این مقاله به اصول عملکرد SPR و کاربردهای آن در حوزه حسگری علوم پزشکی اشاره خواهد شد (1). 

1- مقدمه

زیست حسگرها برای اولین بار در سال 1962 با توسعه الکترودهای آنزیمی توسط لنارد سی کلارک [Lenard C. Clark] (پدر علم زیست حسگر) معرفی شدند. حسگرها گروهی از تجهیزات هستند که در برابر تغییرات فیزیکی یا شیمیایی پاسخ قابل اندازه گیری تولید می‌کنند. به طور کلی، یک زیست حسگر شامل یک جز زیستی [Bioreceptor](اسیدهای نوکلئیک، آنزیم، آنتی‌بادی و غیره) و یک مبدل سیگنال است و سیگنال متناسب با غلظت آنالیت [Analyte] تولید می‌کند. پس از شناسایی آنالیت توسط جزء زیستی، مبدل، تغییرات صورت گرفته در زیست مولکول را به سیگنالی متناسب با عملکرد حسگر که می‌تواند الکتریکی، نوری، مکانیکی و ... باشد، تبدیل می‌کند. گیرنده نسبت به آنالیت یا ماده‌ای که مورد سنجش قرار می‌گیرد، بسیار اختصاصی عمل می‌کند و فقط نسبت به آن حساسیت نشان می‌دهد، به طوری که آنالیت‌های دیگر را تشخیص نمی‌دهد. حسگرها برای اندازه‌گیری تغییرات زیستی و شیمیایی استفاده می‌شوند. ویژگی‌هایی مانند: حساسیت بالا، پاسخ سریع و هزینه پایین، زیست حسگرها را به عنوان ابزاری مؤثر برای کاربردهای مختلف به خصوص در زمینه زیستی و پزشکی معرفی می‌کند (2,3).

 

filereader.php?p1=main_c4ca4238a0b923820

شکل 1. تصویر شماتیک از عملکرد یک زیست حسگر

 

زیست حسگرها مانند حسگرها، پاسخ قابل اندازه‌گیری در اثر تغییرات از خود بروز می‌دهند اما تفاوت اساسی آن با حسگرها این است که اجزایی که در عمل حسگری به کار می‌روند، ساختارهای زیستی مانند: سلول‌ها، آنزیم‌ها و نوکلئیک اسیدها هستند. زیست حسگرها به علت ویژگی‌هایی مانند: سرعت، صحت و حساسیت بالا، هزینه پایین و قابل اعتماد بودن نتایج، برای شناسایی و تشخیص آنالیت‌های اختصاصی استفاده می‌شوند (4,5).

زیست حسگرها به انواع مختلف شامل، زیست حسگرهای نوری، زیست حسگرهای الکتروشیمیایی و زیست حسگرهای پیزوالکتریک طبقه‌بندی می‌شوند. اساس تشخیص در زیست حسگرهای نوری بر مبنای تغییر در ویژگی‌های نوری، در زیست حسگرهای الکتروشیمیایی بر مبنای تغییرات در ویژگی‌های الکتریکی و در زیست حسگرهای پیزوالکتریک بر مبنای تغییرات در حجم است. زیست حسگرهای نوری ابزاری قدرتمند در شناسایی و آنالیز هستند و در حوزه‌های گوناگونی از قبیل: زیست پزشکی، سلامت، دارویی [Pharmaceutical]، پایش [Monitoring] محیط زیست، امنیتی و غیره کاربرد دارند (6).

زیست حسگرهای نوری نسبت به تداخلات الکترومغناطیسی مقاوم هستند و به علت این مقاومت می‌توانند از راه دور نیز مورد پایش و بررسی قرار گیرند. در شناسایی بر اساس فلوئورسانس، هر دو مولکول هدف و شناساگر زیستی توسط برچسب‌های فلوئورسنتی مانند رنگ‌ها نشاندار می‌شوند و شدت فلوئورسانس نشان‌دهنده وجود مولکول‌های هدف و پیوند قوی بین مولکول‌های شناساگر زیستی و هدف است. اگرچه شناسایی بر پایه فلوئورسانس حساسیت خاص خود را دارد، اما تنها محدود به شناسایی یک مولکول است. مرحله برچسب‌دار کردن مولکول به عملکرد مولکول آسیب می‌زند و تعداد فلوئوروفورها بر روی هر مولکول به درستی کنترل نمی‌شود و در محاسبات کمی اختلال ایجاد می‌کند. برخلاف روش فلوئورسانس، در شناسایی برچسب آزاد، مولکول‌های هدف دچار تغییر یا علامت گذاری نمی‌شوند و در حالت طبیعی خود، مورد شناسایی قرار می‌گیرند. این روش شناسایی نسبتاً آسان و ارزان است و اجازه اندازه‌گیری کمی و کینتیک [Kinetic] تعاملات بین مولکولی را می‌دهد. این روش شناسایی اساس کار زیست حسگرهای تشدید پلاسمون‌های سطحی است (7,8).

اولین استفاده از تشدید پلاسمون‌های سطحی در سال 1990 میلادی انجام شد و پس از آن، SPR به عنوان یکی از فناوری‌های زیست حسگری نوری در حوزه‌های شیمی، زیست و پزشکی شناخته شد. ویژگی‌های SPR، سنجش در زمان واقعی، بدون برچسب و غیر تهاجمی بودن این فناوری است.

 

2- اصول فیزیکی حاکم

1-2- پدیده بازتاب داخلی کلی (TIR:Total Internal Reflection) و موج‌های فرودی

بازتاب داخلی پدیده‌ای هست که در آن وقتی نور با زاویه تابش مشخص از محیط غلیظ وارد محیط رقیق می‌شود، نسبت به مسیر اولیه از خط عمود بر فصل مشترک دو محیط رقیق و غلیظ فاصله می‌گیرد. اگر زاویه تابش به اندازه مشخصی برسد، پرتو شکست به جای ورود به محیط رقیق از فصل مشترک دو محیط خارج می‌شود به این اندازه از زاویه تابش زاویه حد گفته می‌شود. اگر زاویه تابش از این مقدار بیشتر شود، پرتو اصلاً وارد محیط رقیق نمی‌شود و به محیط اول بازتابش می‌کند که به آن بازتابش کلی می‌گویند. در شکل 2 این پدیده قابل مشاهده است. هنگامی که نور از محیط با ضریب شکست زیاد یا محیط 1 وارد محیط با ضریب شکست کمتر یا محیط 2 می‌شود پدیده بازتاب داخلی کلی در محیط 1 اتفاق می‌افتد و در آن زاویه تتا (Ѳ) بزرگ‌تر از زاویه بحرانی (Ѳc) است و sin(Ѳc)= n2/n1 است. موج‌های فرودی در محیط 2 و با ضریب شکست پایین‌تر تحت شرایط TIR تشکیل می‌شوند. دامنه این نوع از موج‌ها (موج میرا) با فاصله بین دو محیط 1 و 2 از بین می‌رود. زمانی که لایه طلای غیرمغناطیسی با ضخامت مناسب در فصل مشترک قرار می‌گیرد، موج فرودی تقویت شده و به لایه طلا نفوذ می‌کند و در محیط 2 قرار می‌گیرد. بزرگی بردار موج موازی با موج فرودی (Kevan) به شکل معادله 1 بیان می‌شود:

معادله 1:  filereader.php?p1=main_cf81bc44599fcd8b7

 

که در این فرمول λ طول موج نور فرودی، n1 ضریب شکست محیط با ضریب شکست بالاتر یا محیط 1 و θ زاویه فرودی است.

 

filereader.php?p1=main_c81e728d9d4c2f636

شکل 2. تصویر شماتیک از 1 و 2) زاویه تابش، 3) زاویه حد و 4) بازتاب

 

2-2- پلاسمون سطحی

پلاسمون سطحی (SP: Surface Plasmon) یک موج الکترومغناطیسی با قابلیت عملکرد بالا است که در فصل مشترک فلز – دی‌الکتریک در سطح فلز در ناحیه طول موج نوری به دام می‌افتد. پلاسمون سطحی ویژگی‌های منحصر به فردی، به دلیل نوسان الکترون‌های رسانش در نزدیکی سطح فلز در اثر تهییج به واسطه نور فرودی، از خود به نمایش می‌گذارد. در مقیاس نانومتر، نانوذرات فلزی نسبت سطح به حجم بالایی دارند و در نتیجه ویژگی‌های نوری، الکترونیکی، مغناطیسی و شیمیایی متفاوتی نسبت به حالت مولکولی و توده (بالک) خود پیدا می‌کنند. زمانی که میدان الکترومغناطیسی فرودی با نانوذرات فلزی برهمکنش می‌دهد، الکترون‌های رسانش سطحی فلز به صورت جمعی و یکپارچه توسط تشدید با فرکانس نور نوسان می‌کنند و این پدیده به دلیل شبکه بلوری نانوذرات و جاذبه کولومبی بین الکترون‌ها و هسته نانوذرات فلزی است. این نوسان جمعی الکترون‌ها در تشدید با فرکانس نور فرودی منجر به تشدید پلاسمون‌های سطحی بر روی سطح نانوذرات فلزی می‌شود. بزرگی بردار موج پلاسمون سطحی (Ksp)، وابسته به ثابت‌های دی الکتریک لایه طلا و محیط 2 است. برای محیط غیر جاذب، ثابت دی الکتریک برابر با مربع ضریب شکست n2 = ɛ است که در آن ɛ ثابت دی الکتریک و n ضریب شکست است. بنابراین، ksp توسط دو فاکتور n2 و ng با توجه به معادله 2 محاسبه می‌شود:

معادله 2: filereader.php?p1=main_3ead30037e14a4e32 

 

که n2 ضریب شکست محیط 2 در محدوده فصل مشترک و ng ضریب شکست لایه طلا است.

 

3-2- تشدید پلاسمون‌های سطحی

پلاسمون سطحی می‌تواند توسط موج فرودی تهییج شود که به این پدیده رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) گویند. زمانی که این پدیده رخ می‌دهد، شدت نور بازتابیده به شدت کاهش می‌یابد. انهدام پلاسمون سطحی تهییج شده شامل تبدیل انرژی به فونون یا فوتون است. برای این که SPR رخ دهد باید Ksp=Kevan باشد. بنابراین با استفاده از معادله 1 و2:

filereader.php?p1=main_80a69d3d5320ad766

زاویه‌ای که برای رزونانس نیاز است (θSPR) زمانی که n1 و ng ثابت باشد، وابسته به n2 است. جذب و واجذب روی سطح طلا باعث تغییر ضریب شکست محیط 2 نزدیک فصل مشترک فلز-دی الکتریک می‌شود و به همان نسبت زاویه رزونانس نیز تغییر می‌کند. بنابراین، پایش تغییرات θSPR برای بررسی جذب-واجذب یا اتصال-انفکاک روی سطح طلا به کار می‌رود.

 

3- دستگاهوری SPR

چیدمان کرچمن [Kretschmann] در بیشتر دستگاه‌های SPR استفاده می‌شود و در شکل 3 ساختار آن مشاهده می‌شود. در این چیدمان، لایه‌ای از فلز (معمولاً طلا یا نقره) در فصل مشترک دو محیط دی الکتریک قرار می‌گیرد. محیط 1 منشوری است که دارای ضریب شکست بالاتر (n1) است و محیط 2 با ضریب شکست پایین‌تر(n2) می‌تواند هوا یا محلول مورد نظر باشد.

 

filereader.php?p1=main_eccbc87e4b5ce2fe2

شکل 3. تصویر شماتیک از چیدمان کرچمن در دستگاه SPR

 

دستگاه SPR بر اساس چیدمان کرچمن دارای سه جز اصلی است. اولین جز مهم، منبع نور است که اغلب دیود منتشر کننده نور (LED:Light Emitting Diode) با کارکرد بالا و در محدوده مادون قرمز نزدیک است. دومین جزء اصلی سیستم، چیپ حسگر است که شامل لایه طلا با ضخامت 40 تا 50 نانومتر است که به سطح شیشه متصل می‌شود (شیشه دارای ضریب شکست بالاتر از طلا است). طلا دارای ضریب شکست پایین‌تری است و در بافرهای فیزیولوژیک، ساکن و غیر فعال است و برای بهبود و افزایش تثبیت مواد بر روی سطح به کار می‌رود و محیط انتشار موج میرا را فراهم می‌کند. لایه دی الکتریک شیشه و طلا برای دستیابی به پدیده TIR در سطح به منشور متصل می‌شود. سل تست به لایه طلا متصل می‌شود و توسط محلول‌های مختلفی که مورد مطالعه قرار خواهد گرفت، پر می‌شود. زمانی که باریکه نور در منشور منتشر می‌شود و به فصل مشترک لایه طلا و محلول برخورد می‌کند، پدیده بازتاب داخلی کلی (TIR) روی می‌دهد و موج فرودی که دارای زاویه فرودی بزرگ‌تر از زاویه بحرانی است، تابانده می‌شود. شدت نور بازتابیده معمولاً توسط زاویه فرودی تحت شرایط TIR تغییر نمی‌کند و در زاویه خاصی بزرگ‌تر از زاویه بحرانی، موج فرودی، الکترون‌های جابه جا شده یا پلاسمون‌های لایه طلا را تهییج می‌کند که باعث پدیده SPR‌ می‌شود. شدت نور بازتابیده در این نقطه به شدت کاهش می‌یابد. زاویه فرودی که کمترین میزان بازتاب در آن مشاهده می‌شود، زاویه SPR نامیده می‌شود. زمانی که منشور ثابت است، زاویه SPR با تغییر ضریب شکست محلول در فصل مشترک تغییر می‌کند و تغییر ضریب شکست محلول به علت اتصال مواد مختلف به سطح لایه طلا و تغییر غلظت و حجم اتفاق می‌افتد. فناوری SPR برای آنالیز تعاملات و واکنش‌ها در محدوده فصل مشترک و با حدود فاصله 200 نانومتر از سطح طلا استفاده می‌شود. منحنی بازتاب معمول نسبت به منحنی زاویه فرودی نشان می‌دهد که زاویه SPR در هوا 35/21 درجه است. با توجه به شکل 4 هرچه اجزای بیشتری روی سطح طلا قرار گیرد و اتصالات بیشتری رخ دهد زاویه SPR تغییر بیشتری به سمت افزایش زاویه پیدا می‌کند. همانطور که در شکل 4 مشاهده می‌شود، با اتصال ایمونوگلوبولین (G (IgG به پروتئین A، زاویه SPR به اندازه 2/1 درجه افزایش می‌یابد. با افزایش بیشتر ناحیه Fab ایمونوگلوبولین G یا همان واکنش آنتی‌ژن – آنتی‌بادی، زاویه SPR به اندازه 1/2 درجه دیگر افزایش پیدا می‌کند. تغییر زاویه SPR به طور خطی متناسب با تغییرات حجم بر روی سطح است.

 

 filereader.php?p1=main_a87ff679a2f3e71d9

شکل 4. A) افزایش زاویه SPR با اتصال مولکول‌های بیشتر به سطح طلا. B) تصویر شماتیکی از لایه‌های تشکیل شده روی سطح لایه طلا.

 

جز کلیدی سوم دستگاه SPR، سیستم شناساگر [Detector] است که می‌تواند شناساگر حسگری موقعیت (position sensing detector:PSD) یا ابزار جفت شده باردار (CCD:charge-coupled device) باشد. سیستم‌های CCD به دلیل حساسیت بالاتر در SPR بیشتر استفاده می‌شوند. اساس کار CCD استفاده از آرایه‌های خطی دیودهای حساس به نور یا پیکسل‌ها برای پوشش محدوده‌ای از زوایای نور فرودی با رزولوشن یا قدرت تفکیک 10-5 است.

 

filereader.php?p1=main_e4da3b7fbbce2345d

شکل 5. رایج‌ترین سیستم SPR بر اساس چیدمان کرچمن. دایره‌ها و Yهای معکوس در شکل به ترتیب آنالیت و مولکول‌های لیگاند در سیستم هستند. در این شکل، لیگاندها شامل آنتی بادی‌های مونوکونال (mab) هستند که بر روی سطح طلا تثبیت شده اند. دایره‌های قرمز رنگ، آنتی‌ژن‌ها (Ag) هستند که به طور اختصاصی و انتخابی به آنتی بادی متصل می‌شوند. منبع نور، لیزر هلیوم – نئون (He-Ne) است. شناساگر اغلب یک CCD است.

 

4- آماده‌سازی و تثبیت نمونه

به طور کلی، سه رویکرد برای تثبیت مولکول‌ها و آماده‌سازی سطح اتخاذ می‌شود. اولین رویکرد شامل تثبیت مستقیم لیگاند یا مولکول مورد نظر به صورت کووالانسی به سطح حسگر طلا است. برخی از لیگاندهای مورد استفاده شامل: آمین، تیول، آلدهید و غیره است. به عنوان مثال، گروه آمین می‌تواند گروه‌های آمین اولیه آزاد در آمینواسید لیزین یا انتهای N پروتئین باشد. تکنیک تثبیت مولکول روی سطح و شیوه گزینش آن باید به گونه‌ای باشد که پیوندهای غیر اختصاصی را به حداقل برساند، حجم مناسبی از مواد بر روی سطح قرار گیرد و از همه مهم‌تر این که ویژگی‌های ذاتی و ساختاری مولکول آنالیت را حفظ کند. در طی مرحله تثبیت مولکول‌ها روی سطح باید از تراکم بسیار بالای لیگاند، تجمع و پیوندهای غیر اختصاصی جلوگیری شود. اتصال مستقیم و بدون واسطه لیگاند به مولکول مورد نظر برای لیگاندهای با خلوص بالاتر (بیشتر از 90%) استفاده می‌شود اما دارای معایبی هنگام استفاده از لیگاندهای مختلف و ناهمگون است. همچنین برای نمونه‌های پروتئینی، باید pH و نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین برای بهینه سازی شرایط تثبیت مورد توجه قرار گیرد.

رویکرد دوم برای تثبیت لیگاند بر روی سطح استفاده از اتصال غیرکووالانسی غیر مستقیم از طریق مولکول‌های گیراندازنده با تمایل بالا برای اتصال است. مولکول‌های گیراندازنده شامل: آنتی‌بادی‌های مونوکلونال (mAbs)، مولکول آویدین-بیوتین از طریق بیوتینیلاسیون [Biotinylation] یا استفاده از برچسب (تگ)های با خلوص بالا در فرایند خالص‌سازی پروتئین مانند: برچسب هیستدین نوترکیب است. در این رویکرد، مولکول گیراندازنده به صورت کووالانسی به سطح حسگر و به صورت غیرکووالانسی به لیگاند مد نظر متصل می‌شود. این تکنیک غیرمستقیم یا گیراندازنده باعث استفاده از لیگاندهای با خلوص کمتر می‌شود زیرا گیراندازی تمایلی خودش واجد مرحله خالص‌سازی نیز هست. مزیت دیگر رویکرد دوم، ایجاد لایه‌های متحدالشکل، یکنواخت یا هوموژن است زیرا تمام مولکول‌های آنالیت تمایل به شکل‌گیری یکسان و منظم در مکان مورد نظر دارند. مزیت نهایی تثبیت بر اساس گیراندازی تمایلی این است که در این رویکرد، از دست رفتن فعالیت زیستی یا از دست دادن تمامیت ساختاری مولکول لیگاند به ندرت اتفاق می‌افتد. 

رویکرد سوم استفاده از مواد لنگراندازنده [Anchoring] به پروتئین‌های غشایی است. برای مثال، جذب لیپیدها از لیپوزوم یا میسل به سطح حسگر می‌تواند مطالعات واکنش‌های لیگاندهای متصل شده به غشا را کنترل کند.

 

5- آنالیز با تکنیک SPR

زاویه SPR دارای رابطه خطی با ضریب شکست (Refractive Index:RI) محلول در فصل مشترک است. زوایای SPR در محیط‌های با ضریب شکست متفاوت اندازه‌گیری شده‌اند. در شکل 6 ارتباط بین زاویه SPR و ضریب شکست نمایش داده شده است.

 

filereader.php?p1=main_1679091c5a880faf6

شکل 6. همبستگی بین ضریب شکست و زاویه SPR

 

اندازه‌گیری از طریق تکنیک SPR بدون نیاز به برچسب است، یعنی نیاز به مواد رنگی یا فلوئورسانس برای شناسایی سیگنال ندارد، برای مطالعه اجزای غذایی، مواد سمی یا توکسین‌ها، پاتوژن‌ها یا مواد بیماری‌زا، ویتامین‌ها، پروتئین‌های درمانی، نشانگرهای زیستی سرطان، آنتی‌بادی‌های تشخیصی، آلاینده‌های محیطی، شناساگرهای بیماری‌های قلبی، هورمون‌ها و الیگونوکلئوتیدها به کار می‌رود (1,9).

 

6- استفاده از نانوذرات طلا در رزونانس پلاسمون‌های سطحی

برای حسگری نوری با استفاده از نانوذرات طلا، ویژگی‌های نوری توسط نوسان جمعی الکترون‌های باند رسانشی یا پلاسمون‌ها در پاسخ به تابش الکترومغناطیس خارجی ایجاد می‌شود. این رزونانس، نوسان منسجم الکترون‌های رسانش سطحی است که توسط تابش الکترومغناطیسی تهییج می‌شود. اتصال و پیوند مولکول‌های اختصاصی بر روی سطح لایه‌های فلزی می‌تواند تغییراتی در ثابت دی الکتریک القا کند که باعث تغییر در بازتاب نور لیزر از سطح مایع – فلز می‌شود. نانوذرات طلا دارای طیف خاموشی نوری بسیار حساس به ثابت دی الکتریک محیط پیرامون هستند که در دستگاه‌های SPR به طور گسترده استفاده شده‌اند. نانوذرات طلا برای تقویت و افزایش پاسخ زیست حسگر SPR استفاده می‌شوند.

انگلبین [Englebienne] در سال 1998 گزارش کرد که در صورت پوشش سطح نانوذرات طلا توسط آنتی بادی مونوکلونال، جابه جایی قرمز [Red - Shift] در طول موج SPR نانوذرات طلا مشاهده می‌شود. نانوذرات طلا بدون پوشش دارای طول موج اختصاصی مربوط به خود هستند که با توجه به اندازه نانوذرات طلا تعیین می‌شود (3). این طیف‌های مربوط به نانوذرات طلا توسط دستگاه اسپکتروفوتومتری مرئی – فرابنفش قابل شناسایی و اندازه‌گیری است. در صورتی که به سطح نانوذرات طلا مولکول‌های مختلفی از جمله آنتی بادی متصل شود، این اتصال باعث نزدیک‌تر شدن نانوذرات طلا به یکدیگر و جابه‌جایی در طیف نانوذرات طلا به سمت طول موج‌های بیشتر می‌شود که به این پدیده جابه‌جایی قرمز گویند و با مشاهده طیف‌ها می‌توان اتصال مولکول مورد نظر به سطح طلا را شناسایی کرد. در شکل 7 نزدیک شدن نانوذرات طلا به یکدیگر و جابه‌جایی قرمز بعد از اتصال مولکول مورد نظر به سطح نانوذرات طلا نشان داده شده است.

 

filereader.php?p1=main_8f14e45fceea167a5

شکل7. a) طیف‌سنجی مرئی-فرابنفش از نانوذرات طلا و نانوذرات طلای متصل شده به آنتی‌بادی. تصاویر TEM از b) نانوذرات طلا و c) نانوذرات طلای متصل شده به آنتی‌بادی

 

مطابق آن چه در شکل 7 دیده می‌شود، نانوذرات طلای 22 نانومتری پس از اتصال به آنتی‌بادی به30 نانومتر افزایش سایز پیدا کرده‌اند. همچنین جابه‌جایی قرمز 4 نانومتری در طول موج بیشینه مشاهده می‌شود.

مشاهدات انگلبین نشان داد که این جابه‌جایی در طیف ناشی از تجمع یا آگلوتیناسیون [Agglutination] نانوذرات طلا نیست بلکه به علت تغییر در ضریب شکست ذرات منفرد در نتیجه پوشیده شدن توسط لیگاند اختصاصی به هنگام اتصال به آنتی بادی است. پس از این مطالعه، کارهای آزمایشگاهی بسیاری انجام شدند تا همبستگی بین شدت قله و موقعیت جذب پلاسمون سطحی نانوذرات طلا را با ضریب شکست موضعی محیط اطراف ذرات پیدا کنند (3).

شکل 8 نشان‌دهنده این حقیقت است که استفاده از نانوذرات طلا باعث بهبود سیگنال و پاسخ سیستم SPR از طریق جفت شدن الکترونی پلاسمون‌های سطحی نانوذرات طلا و افزایش حجم مولکول‌های تثبیت شده روی مولکول‌های طلا می‌شود. 

 

filereader.php?p1=main_c9f0f895fb98ab915

شکل 8. مکانیسم تقویت سیگنال توسط نانوذرات طلا در زیست حسگرهای SPR. نانوذرات طلا می‌تواند توسط گیرنده‌های زیستی و آنالیت مانند: DNA بر روی زیرلایه تثبیت شود.

 

بسیاری از گروه‌های تحقیقاتی از نانوذرات طلای عامل‌دار برای ارزیابی بهبود و تقویت حسگری استفاده کرده‌اند. تکنیک SPR تقویت شده با نانوذرات طلا برای شناسایی سلول‌های کلرا [Cholera] استفاده شده است. گروه‌های دیگر از SPR تقویت شده با نانوذرات طلا برای شناسایی غلظت پیکومولار ایمونوگلوبولین استفاده کرده‌اند (3).

در مورد کاربرد SPR در طراحی زیست حسگرها، زیست حسگر بسیار حساسی بر اساس اتصال آنتی‌بادی به نانوذرات طلا برای شناسایی آنتی‌ژن اختصاصی پروستات (PSA:Prostate Specific Antigen) توسعه یافته است.

 

filereader.php?p1=main_45c48cce2e2d7fbde

شکل 9. تصویر شماتیک از دستگاه SPR برای شناسایی آنتی‌ژن اختصاصی پروستات

 

همان‌طور که در شکل 9 مشاهده می‌شود، روی زیرلایه‌ای از طلا برای اتصال بهتر آنتی‌بادی لایه‌ای از rProteinG قرار می‌گیرد تا قرارگیری آنتی بادی روی سطح با نظم و چینش و جهت‌گیری بهتری صورت گیرد. بعد از این مرحله، آنتی بادی بر ضد PSA بر روی سطح قرار می‌گیرد و در مرحله بعد آنتی‌ژن PSA روی سطح قرار می‌گیرد. بعد از آن، محلولی که دارای نانوذرات طلای متصل به آنتی بادی بر ضد PSA است، اضافه می‌شود و تغییرات از طریق تغییر در زاویه SPR خوانده می‌شود و میزان اتصال مشخص می‌شود. اضافه کردن نانوذره طلای متصل به آنتی‌بادی در واقع باعث تقویت و حساسیت بهتر سیستم می‌شود و بین غلظت PSA و نانوذرات طلای متصل به آنتی‌بادی رابطه خطی وجود دارد. حساسیت این سیستم حتی تا مرتبه فمتومولار نیز می‌رسد. سیستم‌های بسیاری بر اساس SPR توسعه یافته‌اند و دارای حد تشخیص و حساسیت بالایی هستند که اهمیت استفاده و کاربرد این سیستم‌ها را نشان می‌دهد.

فناوری SPR در تجهیزات و آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شود و این تکنولوژی محدودیت‌های مربوط به خود را دارد. اگرچه تکنیک‌های متعددی برای تثبیت مولکول‌ها بر روی سطح استفاده می‌شود اما هرگونه دستکاری که عملکرد زیستی گونه‌های مورد بررسی را تحت تأثیر قرار دهد، محدودیت در استفاده از SPR ایجاد می‌کند. مولکول‌های کوچک (کوچک‌تر از150 – 180 دالتون) به آسانی توسط دستگاه SPR شناسایی نمی‌شوند. به علاوه پیوندهای غیراختصاصی، ویسکوزیته نمونه، کیفیت نمونه مورد بررسی، نظافت سیستم همگی در کیفیت عملکرد دستگاه SPR تأثیر دارد (9).

 

7- نتیجه‌گیری

سیستم‌های بر پایه رزونانس پلاسمون‌های سطحی (SPR) بیش از دو دهه است که به صورت گسترده در کاربردهای مختلف به خصوص در حوزه علوم پزشکی مورد استفاده قرار گرفته است و این سیستم به صورت غیرتهاجمی و برچسب آزاد به بررسی و شناسایی مولکول‌ها و اجزای مختلف می‌پردازد. در آینده توانایی انجام عملکردهای مختلف با استفاده از این سیستم نوری توسعه خواهد یافت.

 

منابـــع و مراجــــع

Bakhtiar R. Surface plasmon resonance spectroscopy: a versatile technique in a biochemist’s toolbox. Journal of Chemical Education. 2012;90(2):203-9

Clark LC, Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Annals of the New York Academy of sciences. 1962;102(1):29-45.

Li Y, Schluesener HJ, Xu S. Gold nanoparticle-based biosensors. Gold Bulletin. 2010;43(1):29-41

Wei Q, Li T, Wang G, Li H, Qian Z, Yang M. Fe 3 O 4 nanoparticles-loaded PEG–PLA polymeric vesicles as labels for ultrasensitive immunosensors. Biomaterials. 2010;31(28):7332-9

Yang M, Li H, Javadi A, Gong S. Multifunctional mesoporous silica nanoparticles as labels for the preparation of ultrasensitive electrochemical immunosensors. Biomaterials. 2010;12)31):6-3281

Narayanaswamy R, Wolfbeis OS. Optical sensors: industrial environmental and diagnostic applications: Springer Science & Business Media; 2003

Moerner W. New directions in single-mole cule imaging and analysis. Proceedings of the 8. National Academy of Sciences. 2007;104(31):12596-602

Cox WG, Singer VL. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. Biotechniques. 2004;36(1):114-23

Tang Y, Zeng X, Liang J. Surface plasmon resonance: An Introduction to a surface spectroscopy technique. Journal of chemical education. 2010;87(7):742-6