برترین کاربران هفتگی این مقاله

از ۱۳۹۷/۱۲/۲۵ تا ۱۳۹۸/۰۱/۰۲

مقالات مرتبط
اخبار مرتبط
آمار مقاله
  • بازدید کل ۴,۴۸۷
  • بازدید این ماه ۱۵۲
  • بازدید امروز ۱
آمار آزمون مقاله
  • کل شرکت کنندگان ۳۳
  • قبول شدگان ۳۱
  • شرکت کنندگان یکتا ۳۰
  • میانگین درصد شرکت کنندگان ۹۲
واژه نامه فناوری نانو

نانو

nano

پيشوندي به معناي يک بيليونم يا (000،000،000،1/1). در متون فناوري‌نانو، معمولا براي مشخص کردن يک واحد اندازه‌گيري برابر با 10 به توان منفي 9 متر استفاده مي‌شود.

سطح مقاله

پیشرفته 2

نویسندگان
کلمات کلیدی
امتیاز کاربران

آزمون‌های برون‌تن (in vitro) بررسی سمیت نانومواد

فناوری نانو به‌عنوان یکی از فناوری‌های کلیدی قرن 21 در نظر گرفته می‌شود. مواد در مقیاس نانو، خصوصیات و عملکرد جدیدی نسبت به مواد مشابه غیرنانویی خود پیدا می‌کنند که به‌دلیل اندازه کوچک و سطح بزرگ آن‌ها است. مطالعات نشان داده است که همان خصوصیاتی که نانوذرات را منحصر به‌فرد ساخته است می‌تواند باعث سمیت بالقوه آن‌ها شود. فناوری نانو به سرعت در حال پیشرفت است و بیش از 1000 نانوذره در حال حاضر در بازار موجود است. با توجه به این که مواجهه با نانومواد در حال افزایش است و در حال حاضر هیچ راهکار قانونی روشنی برای ارزیابی نانوذرات در دسترس نیست، مطالعات سم شناسی در شرایط آزمایشگاهی (برون‌تن) بسیار مهم است. بنابراین در این مقاله خلاصه‌ای از روش‌های مورد استفاده در ارزیابی سمیت نانوذرات در شرایط آزمایشگاهی ارائه می‌شود. انجام این بررسی‌ها قبل از ورود نانومواد به بازار بسیار مهم و ضروری است تا از بروز اثرات نامطلوب آن‌ها بر انسان و محیط جلوگیری شود.
1- مقدمه

تولید و استفاده روزافزون نانومواد با توجه به تأثیراتی که بر سیستم‌های زیستی دارند، باعث بروز نگرانی‌هایی در میان افراد جامعه و همچنین دانشمندان شده است. کاربرد نانومواد در امور پزشکی از جمله تصویربرداری و دارورسانی باعث شده نانومواد تماس مستقیم با بدن انسان پیدا کنند [1]. بیشتر مطالعات سم شناسی بر روی نانوموادی مانند فلزات، اکسیدهای فلزی، نانولوله‌های کربنی، فولرن‌ها، نانوذرات پلیمری و نقاط کوانتومی صورت گرفته است. با توجه به اندازه بسیار کوچک و سطح بزرگ نانومواد که منجر به تغییر خواص فیزیکی و شیمیایی آن‌ها می‌شود [2,3]، می‌توان انتظار داشت که مواد نانومقیاس بسیار واکنش‌پذیر باشند [4]. واکنش‌پذیری بالای نانومواد باعث می‌شود آن‌ها برهمکنش‌های مضری با سیستم‌های زیستی و محیط داشته و در نتیجه ایجاد سمیت کنند [5]. کوچک بودن اندازه نانومواد همچنین باعث می‌شود بتوانند به نواحی عمیق‌تری در سیستم‌های زیستی نفوذ کنند که این مناطق برای ذرات بزرگ‌تر قابل دسترسی نیستند [6]. آزمایش‌های برون تن همواره اولین انتخاب برای سم شناسان بوده‌اند زیرا از نظر زمان و هزینه مقرون به صرفه‌اند.اگر چه این آزمایشات نمی‌توانند به طور کامل جایگزین آزمایشات حیوانی (درون تن [In vivo]) شوند ولی گاهی اوقات اطلاعات مفیدی درمورد مکانیسم‌ها و فرایندهای سمیت نانومواد در اختیار ما قرار می‌دهند [7,8]. اگر بخواهیم سمیت نانومواد را در مدل‌های حیوانی بررسی کنیم این امر مستلزم درک کامل کینتیک و دینامیک سم شناسی نانوذرات است و اصول اخلاقی و ایمنی استفاده از ذرات در بدن موجود زنده نیز باید رعایت شود. علاوه بر این، باید اطلاعات جامعی از ایمنی یا قابلیت خطر این مواد در شرایط درون تن در اختیار داشته باشیم [9]. نانوتوکسیکولوژی شاخه جدیدی از سم شناسی است که می‌تواند روش‌های قابل اعتمادی را برای ارزیابی اثرات نامطلوب و سمیت احتمالی نانومواد ارائه دهد [10].

 

2- روش‌های ارزیابی سمیت نانومواد

هر ماده‌ای که توسط انسان ساخته می‌شود باید در شرایط برون تن و درون تن مورد آزمایش قرار گیرد تا اثرات زیستی آن مشخص شود. نانومواد نیز از این قاعده مستثنی نیستند. سیستم‌های برون تن ابزاری کارآمد و سریع برای ارزیابی نانوذرات در اختیار محققان قرار می‌دهند. این سیستم‌ها همچنین می‌توانند اطلاعات مفیدی درمورد مکانیسم‌ها و چگونگی برهمکنش نانوذرات با سلول‌های انسانی ارائه دهند. چنین مطالعاتی می‌تواند برای بیان ارتباط بین غلظت نانومواد و اثرات آن‌ها مورد استفاده قرار گیرد. بسیاری از این آزمایش‌ها نیاز به استفاده از سیستم‌های درون تن را برطرف می‌سازد. برخی از مزایای سیستم‌های برون تن عبارتند از: (1) مشخص کردن مکانیسم‌های سمیت در غیاب عوامل فیزیولوژیکی و سایر عواملی که تفسیر مطالعات درون تن را دشوار می‌سازد، (2) سرعت، کارآمد بودن و مقرون به‌صرفه بودن، (3) ایجاد دیدگاه بهتر برای طراحی مطالعات حیوانی [11]، (4) نیاز به مواد مصرفی کمتر و در نتیجه تولید پسماند سمی کمتر، (5) امکان استفاده از سلول‌های انسانی در آزمایش [12]. البته باید خاطر نشان کرد که تنها استفاده از آزمایشات برون تن برای ارزیابی سمیت نانومواد کافی نسیت زیرا سلول‌ها در محیط کشت نمی‌توانند اثرات آسیب‌زا و بیماری‌زای موجود در شرایط داخل بدن را تجربه کنند [13]. بنابراین توصیه می‌شود که برای ارزیابی دقیق‌تر سمیت نانوذرات، در کنار روش‌های برون تن از روش‌های حیوانی و روش‌های تصویربرداری مانند میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نیز استفاده شود [14].

در حال حاضر روش‌هایی که برای ارزیابی برون تن نانوذرات وجود دارد دارای دستوالعمل روشنی از سوی مؤسسات نظارتی و قانونگذار نیست. این آزمون‌ها با استفاده از رده‌های سلولی و سلول‌های اولیه به دست آمده از بافت‌های مورد نظر انجام می‌شوند و بسیار مهم هستند. به طور کلی، تمام آزمایش‌های فعلی که در زمینه‌های زیست شناسی سلولی و سم شناسی به کار برده می‌شوند، می‌توانند برای بررسی سمیت نانومواد نیز مورد استفاده قرار گیرند. این آزمایش‌ها عبارتند از؛ (1) سنجش برون تن میزان زنده بودن و تکثیر و نیز روش‌های تعیین مکانیسم رویدادها مانند تولید گونه‌های فعال اکسیژن، آپوپتوز، نکروز، آسیب DNA ،(2) ارزیابی میکروسکوپی از محل قرار گرفتن داخل سلولی نانومواد به کمک روش‌هایی مانند میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)، طیف سنجی فلورسانس، رزونانس مغناطیس هسته (MRI) و غیره، (3) تجزیه و تحلیل بیان ژن، (4) سمیت ژنی و غیره.

به طور معمول اولین گام برای درک چگونگی برهمکنش یک ماده در بدن، مطالعات کشت سلولی است. در مقایسه با مطالعات حیوانی، مطالعات برون تن کمتر با ملاحظات اخلاقی سروکار دارند، راحت‌تر کنترل می‌شوند، به دفعات بیشتری می‌توان آن‌ها را تکرار کرد و علاوه بر تمام این‌ها، کم هزینه‌تر هستند. در مورد آزمایش‌های سمیت سلولی، علاوه بر این که دانستن غلظت ماده سمی مورد آزمایش مهم است، سایر عوامل مانند نوسانات دما، pH، مواد مغذی و مواد زائد موجود در محیط کشت نیز نقش تأثیرگذاری بر نتایج آزمایش دارند. بنابراین، کنترل شرایط آزمایش بسیار مهم است تا اطمینان حاصل شود که آیا مرگ سلولی در نتیجه سمیت نانوذرات اضافه شده به سلول‌ها یا به خاطر شرایط ناپایدار کشت است. انتخاب روش تعیین سمیت سلولی نیز بسیار مهم است زیرا نانوذرات ممکن است عامل رنگی و سایر عوامل مرتبط با روش تست را روی سطح خود جذب کنند و در نتایج آزمون اختلال ایجاد شود. انجام آزمایش‌های متعدد برای اطمینان از نتیجه‌گیری معتبر و صحیح سودمند است [1]. اثرات زیستی نانومواد اغلب شامل برهمکنش با اجزای سلولی نظیر غشای پلاسمایی، اندامک‌های داخل سلولی یا ماده ژنتیکی سلول است. انجام مطالعات سمیت سلولی برای تمام انواع نانومواد بسیار مهم است زیرا هر یک از آن‌ها اثرات زیستی منحصر به فردی دارند. از میان تمام روش‌های مورد استفاده برای ارزیابی سمیت سلولی نانومواد، روشی که بتواند تمام اطلاعات سمیت سلولی این مواد را در اختیار محقق قرار دهد وجود ندارد. بنابراین برای مطالعه مکانیسم سمیت نانوذرات باید آزمایش‌های متعدد سمیت سلولی مورد استفاده قرار گیرند. در ادامه به برخی از روش‌های برون تن ارزیابی سمیت سلولی نانومواد اشاره شده است.

 

1-2-آزمون MTT (3-(4،5 - دی متیل تیازول)-2،5-دی فنیل تترازولیوم برمید) جهت بررسی اثر سمیت سلولی نانومواد بر رشد و تکثیر سلول‌ها می‌توان از روش رنگ سنجی MTT استفاده کرد. پودر MTT یک نمک تترازولیوم محلول در آب است. نمک‌های تترازولیوم از گروه وسیعی از ترکیبات آلی تشکیل شده‌اند که بعد از احیا شدن اغلب به صورت ترکیب فورمازان پررنگ و غیرمحلول در می‌آیند. این ترکیبات به صورت گسترده‌ای به عنوان نشان‌دهنده پایان واکنش‌های احیا و زنده بودن سلول مصرف می‌شوند. در این روش سلول‌های زنده در تماس با محلول MTT رسوب بنفش رنگی تولید می‌کنند (شکل 1). هر چه سلول‌ها فعال‌تر و تعدادشان بیشتر باشد، میزان رنگ ایجاد شده بیشتر است. پس از انحلال این رسوب در حلال مناسب، میزان دانسیته نوری نمونه ها اندازه‌گیری می‌شود [15].



filereader.php?p1=main_c4ca4238a0b923820
شکل 1: احیا رنگ تترازولیوم (MTT) توسط آنزیم‌های سلولی و تبدیل آن به بلورهای بنفش رنگ فورمازان در سلول‌های زنده

 

2-2- آزمون قرمز خنثی (Neutral red)
روش neutral red یک روش رنگ‌سنجی است که میزان زنده بودن سلول‌ها را در شرایط برون تن با استفاده از رنگ neutral red ارزیابی می‌کند. مبنای این آزمون بر توانایی سلول‌های زنده در دخول این رنگ به آن‌ها است. این رنگ به غشا سلولی نفوذ می‌کند و در لیزوزوم‌ها قرار می‌گیرد [16]. در ادامه، رنگ به وسیله یک محلول اسیدی از سلول‌های زنده خارج شده و جذب محلول رنگی با استفاده از اسپکتروفوتومتر تعیین می‌شود. به طور کلی می‌توان گفت که روش neutral red یک تخمین کمی از تعداد سلول‌های زنده در کشت سلول فراهم می‌کند. این روش ارزان‌تر و در پاره‌ای موارد حساس‌تر از سایر آزمون‌های سمیت سلولی نظیر استفاده از نمک‌های تترازولیوم است.

3-2- آزمون رهایش لاکتات دهیدروژناز (LDH)
روش لاکتات دهیدروژناز وسیله‌ای برای اندازه‌گیری تعداد سلول‌های زنده از طریق اندازه‌گیری میزان LDH آزاد شده سیتوپلاسمی به داخل محیط کشت است [17]. لاکتات دهیدروژناز آنزیمی است که واکنش‌های اکسیداسیون و احیا را کاتالیز می‌کند. سلول‌ها پس از آسیب دیدن یا مرگ، LDH را به داخل محیط کشت خود آزاد می‌کنند. این روش مبتنی بر احیا NAD (نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید) به وسیله LDH است. NAD احیا شده (NADH) در تبدیل یک رنگ تترازولیوم مورد استفاده قرار می‌گیرد. ترکیب رنگی حاصل به صورت فوتومتری اندازه‌گیری می‌شود (شکل 2). LDH یک آنزیم نسبتاً پایدار بوده و به طور گسترده برای ارزیابی درصد آسیب و سمیت بافت و سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد.

filereader.php?p1=main_c81e728d9d4c2f636
شکل 2: آسیب غشا سلول باعث آزاد شدن LDH سیتوپلاسمی به فضای خارج سلول و احیا NAD به NADH شده که با تغییر رنگ یک نمک تترازولیوم، میزان LDH آزاد شده اندازه‌گیری می‌شود.
 
4-2- آزمون همولیز
آزمون همولیز برای ارزیابی سازگاری زیستی نانومواد به‌کار می‌رود. در این روش اثر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی نانوذرات مانند اندازه، تخلخل و گروه‌های سطحی بر روی گلبول‌های قرمز خون (RBC) انسان با اندازه‌گیری میزان هموگلوبین آزاد شده مورد ارزیابی قرار می‌گیرد [18].

5-2- آزمون کاسپاز-3
آپوپتوز مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی است و به عنوان روشی حفاظت شده، تحت کنترل ژن‌هاست که به منظور حذف سلول‌های ناخواسته یا غیرضروری در موجودات زنده به کار می‌رود. طی آپوپتوز بسیاری از اندامک‌های سلول مانند میتوکندری و اسکلت سلولی تغییر می‌کنند و DNA نیز آسیب می‌بیند. آنزیم کاسپاز-3 نقش مهمی در القای آپوپتوز دارد. کاسپاز-3 در سیتوپلاسم سلول به شکل غیرفعال وجود دارد. در مرحله شروع آپوپتوز، کاسپاز-3 فعال می‌شود. در مرحله پایان دادن به آپوپتوز، فعالیت کاسپاز-3 به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد. با اندازه‌گیری فعالیت این آنزیم می‌توان وضعیت آپوپتوز را بررسی کرد. برای اندازه‌گیری میزان فعالیت کاسپاز-3، پپتید خاصی را در مجاورت سلول آپوپتوتیک قرار می‌دهند و کاسپاز-3 با هیدرولیز این پپتید باعث آزاد شدن قسمتی از پپتید می‌شود که دارای جذب نوری در اسپکتروفوتومتری است. بنابراین با تعیین میزان جذب نوری این ماده می‌توان میزان فعالیت کاسپاز -3 را به دست آورد. آزمون کاسپاز-3 روشی سریع و کارآمد است (شکل 3).
filereader.php?p1=main_eccbc87e4b5ce2fe2
شکل 3: اندازه‌گیری میزان فعالیت کاسپاز-3؛ کاسپاز-3 باعث هیدرولیز پپتیدی خاص می‌شود که با اندازه‌گیری جذب نوری این پپتید می‌توان میزان فعالیت کاسپاز-3 را تعیین کرد.
 
6-2- آزمون گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)
گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) مانند سوپراکسید و هیدروژن پروکسید به طور مداوم در طول فرایند متابولیک بدن تولید می‌شوند. تولید ROS به طور معمول با عمل آنزیم‌های آنتی اکسیدان و برخی مولکول‌های دیگر متعادل نگه داشته می‌شود. با این حال، تولید بیش از حد ROS می‌تواند منجر به آسیب سلولی به صورت تخریب DNA، لیپیدها و پروتئین‌ها شود. برای تشخیص و تعیین گونه‌های اکسیژن فعال دو روش وجود دارد: سنجش ROS داخل سلولی برای سلول‌های سالم و سنجش ROS در شرایط برون تن با استفاده از خون، ادرار یا عصاره سلول یا بافت. اغلب این روش‌ها سریع و با حساسیت بالا هستند و می‌توانند وجود انواع گونه‌های اکسیژن فعال را شناسایی کنند [19].

7-2- آزمون ستاره دنباله‎دار (Comet assay)
از روش سنجش ستاره دنباله‌دار، برای بررسی شکست‌های موجود در رشته‌های DNA استفاده می‌شود. این روش امکان ارزیابی سریع جمعیت بزرگ و تعداد زیاد سلول‌های منفرد یوکاریوتی را میسر می‌سازد. در این روش، سلول مورد نظر در لایه‌ای از ژل آگاروز قرار داده می‌شود و تحت شرایط قلیایی، الکتروفورز می‌شود که در نتیجه DNA آسیب دیده از هسته خارج شده و به سمت آند مهاجرت می‌کند [20]. در نهایت محتویات DNA توسط رنگ‌های فلورسانت رنگ‌آمیزی شده و در زیر میکروسکوپ فلورسانس به شکل یک ستاره دنباله‌دار دارای یک دم و یک سر مشاهده می‌شود (شکل 4). این روش به ژل الکتروفورز تک سلول نیز معروف است.

filereader.php?p1=main_a87ff679a2f3e71d9
شکل 4: سلول با DNA آسیب دیده، در ژل آگاروز قرار داده شده و الکتروفورز می‌شود. DNA آسیب دیده از هسته خارج شده و با مهاجرت به سمت آند به شکل یک ستاره دنباله‌دار مشاهده می‌شود.
 
3- نتیجه‎گیری
فناوری نانو به سرعت در حال پیشرفت است و بدون شک هم اثرات سودمند و هم اثرات سمی و مضر بر روی انسان و محیط خواهد داشت. بنابراین به کارگیری روش‌های مختلف ارزیابی سمیت نانومواد بسیار ضروری و مهم است. از میان روش‌های گوناگونی که بدین منظور توسعه یافته‌اند، روش‌های برون تن به دلیل سرعت، دقت، تکرارپذیری و نیاز به تجهیزات و ملاحظات کمتر نسبت به روش‌های حیوانی، بسیار مورد توجه و استفاده قرار گرفته‌اند. با این حال، این روش‌ها نیز دارای کاستی‌هایی هستند و برای سنجش دقیق‌تر سمیت نانومواد، استفاده از آزمون‌های متعدد برون تن و روش‌های حیوانی توصیه می‌شود.
 

منابـــع و مراجــــع

[1] Lewinski, N., Colvin, V., Drezek, R. “Cytotoxicity of nanoparticles”. Small 4, 26–49,( 2008).

[2] Buffle J. “The key role of environmental colloids/nanoparticles for the sustainability of life”. Environ Chem 3(3):155–158, (2006).

[3] Kahru A, Savolainen K. “Potential hazard of nanoparticles: from properties to biological and environmental effects”. Toxicology 269(2–3):89–91, (2010).

[4] Oberdorster, G., Maynard, A., Donaldson, K., Castranova, V., Fitzpatrick, J., Ausman, K., Carter, J., Karn, B., Kreyling, W., Lai, D., Olin, S., Monteiro-Riviere, N., Warheit, D., Yang, H. “Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy”. Part. Fibre Toxicol. 2, 8–43, (2005a).

[5] Oberdorster, G., Oberdorster, E., Oberdorster, J. “Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles”. Environ. Health Perspect. 113, 823–839, (2005b).

[6] Li, S.-D., Huang, L. “Pharmacokinetics and biodistribution of nanoparticles”. Mol. Pharm. 5, 496–504, (2008).

[7] Doak SH, Griffiths SM, Manshian B, Singh N, Williams PM, Brown AP, Jenkins GJ. “Confounding experimental considerations in nanogenotoxicology”. Mutagenesis 24(4):285–293, (2009).

[8] Song MM, Song WJ, Bi H, Wang J, Wu WL, Sun J, Yu M. “Cytotoxicity and cellular uptake of iron nanowires”. Biomaterials 31(7):1509–1517, (2010).

[9] Nel, A., Xia, T., Madler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science 311, 622–627, (2006).

[10] Donaldson, K., Stone, V., Tran, C.L., Kreyling, W., Borm, P.J.A. “Nanotoxicology”. Occup. Environ. Med. 61, 727–728, (2004).

[11] Huang, Y.-W., C-h, Wu., Aronstam, R.S. “Toxicity of transition metal oxide nanoparticles: recent insights from in vitro studies”. Materials 3, 4842–4859, (2010).

[12] Takhar, P., Mahant, S. “In vitro methods for nanotoxicity assessment: advantages and applications”. Arch. Appl. Sci. Res. 3, 389–403, (2011).

[13] Monteiro-Riviere, N.A., Inman, A.O., Zhang, L.W. “Limitations and relative utility of screening assays to assess engineered nanoparticle toxicity in a human cell line”. Toxicol. Appl. Pharmacol. 234, 222–235, (2009).

[14] Dhawan, A., Sharma, V. “Toxicity assessment of nanomaterials: methods and Challenges”. Anal. Bioanal. Chem. 398, 589–605, (2010).

[15] Ciapetti G, Cenni E, Pratelli L, Pizzoferrato A. “In vitro evaluation of cell/biomaterial interaction by MTT assay”. Biomaterials;13:2021–7, (1993).

[16] Winckler J. Vital. “Staining of lysosomes and other cell organelles of the rat with neutral red”. Progress in histochemistry and cytochemistry. 6(3):1-89, (1974).

[17] Decker T, Lohmann-Matthes M-L. “A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity”. Journal of immunological methods. 115(1):61-9, (1988).

[18] Yu, T., Malugin, A., Ghandehari, H. “Impact of silica nanoparticle design on cellular toxicity and hemolytic activity”. ACS Nano Published online 10.1021/nn2013904, (2011).

[19] Weinberg F, Hamanaka R, Wheaton WW, Weinberg S, Joseph J, Lopez M, Kalyanaraman B, Mutlu GM, Budinger GR, and Chandel NS. “Mitochondrial metabolism and ROS generation are essential for Kras-mediated tumorigenicity”. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 8788–8793, (2010).

[20] Duty, S.M., Singh, N.P., Ryan, L., Chen, Z., Lewis, C., Hunag, T. and Hauser, R. “Reliability of the comet assay in cryopreserved human sperm”. Hum. Reprod., 17, 1274-1280, (2002).