برترین کاربران هفتگی این مقاله

از ۱۳۹۷/۰۷/۲۸ تا ۱۳۹۷/۰۸/۰۴

هیچ کاربری در این بازه زمانی وجود ندارد

آمار مقاله
  • بازدید کل ۲,۳۷۷
  • بازدید این ماه ۵۶
  • بازدید امروز ۰
آمار آزمون مقاله
  • کل شرکت کنندگان ۳
  • قبول شدگان ۳
  • شرکت کنندگان یکتا ۳
  • میانگین درصد شرکت کنندگان ۸۹
واژه نامه فناوری نانو

نانو

nano

پيشوندي به معناي يک بيليونم يا (000،000،000،1/1). در متون فناوري‌نانو، معمولا براي مشخص کردن يک واحد اندازه‌گيري برابر با 10 به توان منفي 9 متر استفاده مي‌شود.

سطح مقاله

پیشرفته 1

نویسندگان
کلمات کلیدی
امتیاز کاربران

روش‌های تعیین سمّیت پوستی نانوذرات

پیشرفت سریع نانوفناوری در تمامی زمینه‌ها و به‌تبع آن ظهور محصولات نانومقیاس، علاوه‌ بر بروز مزایای قابل توجه در زندگی بشر، منجر به ایجاد دریچه‌ای برای محققان این حوزه جهت ارزیابی و توجه به مشکلات ناشی از این دسته مواد در حیطه ایمنی، سلامت و بهداشت شده است. مواد نانومقیاس از راه‌های مختلف می‌توانند به بدن انسان وارد شده و مشکلاتی را برای سلامتی انسان به وجود آورند. هوا، آب، مواد غذایی و مواد دارویی از‌ جمله مسیرهای ممکن در انتقال این مواد به بدن از طریق چشم، پوست و دهان هستند. پوست انسان به دلیل وسعت زیاد، یکی از راه‌های در دسترس برای ورود نانومواد به بدن است. تماس پوست با نانوذرات می‌تواند منجر به ایجاد اثراتی در آن شود. تاکنون آزمایشات متعددی برای ارزیابی سمّیت نانومواد بر روی پوست صورت گرفته است. در این گزارش به رایج‌ترین روش‌های بررسی سمّیت پوستی نانوذرات که شامل آزمایش‌های درون‌تنی (In vivo) و برون‌تنی (In vitro) است، اشاره شده است.
1- مقدمه
رشد سریع نانوفناوری و گسترش آن در همه زمینه‌ها و کاربردهای متعددی قابل مشاهده است. مواد نانومقیاس برای استفاده در بسیاری از محصولات تجاری مثل لوازم آرایشی و بهداشتی، ضدآفتاب‌ها، مواد دارویی، پوشاک مقاوم به لکه، تجهیزات ورزشی، مبدل‌های کاتالیستی وسایل نقلیه، اتصالات دندانی، پاک‌کننده‌ها و ... به کار می‌روند. با‌وجود پیشرفت‌های چشمگیر نانوفناوری که روزانه محصولات جدیدی با کاربردهای نو تولید و به بازار ارائه می‌کند، شکاف بزرگی بین ارزیابی ایمنی نانومواد و توسعه این فناوری دیده می‌شود [1].
ارزیابی عوامل خطرپذیری (ریسک‌پذیری) یک محصول نانومقیاس نیازمند برنامه‌ریزی دقیق است. ارزیابی خطر تابعی از عوامل مخاطره‌آمیز است؛ به‌طور‌ کلی توجه به سه عامل محیطی، سلامتی و ایمنی (EHS: Environmental, Health and Safety) در بررسی مطالعات خطرپذیـــری یک محصــول توصیه می‌شود. در بررسی سمّیت ترکیبات نانو توجه به خاصیت ذاتی ذرات، سمّیت تنفسی، سمّیت پوستی، سمّیت چشمی و دهانی، بررسی‌های جهش ژنی (genotoxicity) و مطالعه سمّیت محصولات در محیط آبی از اهمیت به‌سزایی برخوردار است [2].
جهت ارزیابی سمّیت پوستی، کسب اطلاع از ساختار پوست اهمیت ویژه‌ای دارد. شکل 1 اجزای تشکیل‌دهنده پوست را نشان می‌دهد. به‌طور‌ کلی مسیرهای نفوذ نانوذرات به پوست به چهار دسته تقسیم می‌شوند [1]:
- داخلِ‌سلولی؛
- بینِ‌سلولی؛
- نفوذ از راه انبانک‌های مو (Hair Follicles)؛
- نفوذ از راه غدد عرق.

filereader.php?p1=main_c4ca4238a0b923820
شکل 1- اجزای تشکیل‌دهنده پوست [3].

آزمون‌های بررسی سمّیت نانوذرات به دو دسته آزمون‌های درون‌تنی و برون‌تنی تقسیم می‌شوند. آزمون‌های درون‌تنی آزمایش‌هایی هستند که در آن از موجود زنده استفاده می‌شود و آزمون‌های برون‌تنی آزمایش‌هایی هستند که در محیط کشت سلولی انجام می‌شوند. در زیر به برخی از رایج‌ترین روش‌های بررسی سمّیت پوستی ناشی از حضور نانوذرات به دو روش درون‌تنی و برون‌تنی اشاره شده است. شکل 2 نمای کلی از روش‌های بررسی سمّیت پوستی نانوذرات را نشان می‌دهد.

filereader.php?p1=main_c81e728d9d4c2f636
شکل 2- نمایش روش‌های بررسی سمّیت پوستی نانوذرات.

1-1- بررسی حساسیت پوستی به روش آزمایشگاهی درون‌تنی
روش‌های بررسی حساسیت پوستی به روش درون‌تنی شامل بررسی التهاب پوستی روی حیوانات و بررسی عملکرد غدد تنابه‌ای (لنفاوی) بعد از تماس با نانوذرات است. در بخش زیر به جزئیات این دو روش اشاره شده است.
 

1-1-1- التهاب پوستی
مطالعات التهاب پوستی نانوذرات در حیوانات بر اساس دستورالعمل USEPA و OECD انجام می‌شود. بر‌ این‌ اساس نانوذرات محصول مورد نظر (0/5 گرم) بر روی پوست تراشیده شده خرگوش نر نیوزلندی قرار می‌گیرد؛ سپس سطح مدنظر توسط 0/25 میلی‌لیتر آب یون‌زدائی‌شده (deionized water) مرطوب می‌شود (سطح پوست معمولاً 6 سانتی‌متر مربع است). سطح مورد نظر توسط گاز دولایه پوشیده شده و به مدت 4 ساعت به آن زمان داده می‌شود. بررسی‌های علائم التهاب پوستی در زمان‌های 1، 24، 48 و 72 ساعت بعد از برداشتن نانوذرات از سطح پوست انجام می‌شود [2].

2-1-1- سنجش گره تنابه‌ای موضعی (LLNA: Local Lymph Node Assay)

برای این منظور از دستورالعمل OECD 429 استفاده می‌شود. هدف از این آزمون ارزیابی توانایی بالقوّه نانوذرات در ایجاد عکس‌العمل‌های حساسیت پوستی است. در مطالعه‌ای که از این روش استفاده کرده است مقادیر 0%، 5%، 25%، 50% و 100% از ذرات نرمیزک تیتانیوم‌ دی‌اُکسید (ultrafine TiO2) در اِن و اِن دی‌متیل‌فرمامید (N, N-Dimethyl formamide) پراکنده شده و روی سطح هر دو گوش پنج گروه پنج‌تایی از موش‌های ماده CBA/JHSD به مدت سه روز قرار داده شده است؛ سپس موش‌ها با دریافت وریدی اچ-تایمیدین (H-Tymidine) بعد از 5 ساعت قربانی شده‌اند. بررسی وضعیت غدد تنابه‌ای پشت گوش و مقایسه آن با گروه کنترل، معیاری از میزان حساسیت پوستی ناشی از نانوذرات بوده است [2].

2-1- بررسی سمّیت و التهاب پوستی به روش آزمایشگاهی برون‌تنی

روش‌های کلی بررسی سمّیت و التهاب ناشی از نانوذرات در شرایط آزمایشگاهی برون‌تنی به شکل‌های زیر است [4]:
1. بررسی شکل و اندازه تجمعات سلولی؛
2. بررسی میزان سلول‌های زنده/مرده؛
3. بررسی رهایش زی‌مایه (آنزیم) لاکتات دِهیدروژناز (Enzyme Lactate dehydrogenase)؛
4. بررسی فعالیت میتوکندری (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)؛
5. بررسی میزان تولید زی‌مایه اینترلوکین 8 (IL-8:Interleukin 8)؛
6. بررسی نفوذپذیری نانوذرات به غشاهای پوستی.
در بخش زیر به کاربرد این روش‌ها در مطالعات مختلف پرداخته شده است.

1-2-1- بررسی شکل و اندازه تجمعات سلولی

پوست با سطح ویژه بالا و وسیع یکی از مسیرهای ممکن برای مواجهه با نانوذرات است. کراتینوسیت‌های پوستی (Dermal Keratynocytes) نقش مهمی را در ایجاد سلول‌های پوستی جدید و نگهداری یکپارچگی پوست بر عهده دارند و اغلب به عنوان مدلی برای آزمون‌های سمّیت پوستی انتخاب می‌شوند؛ بنابراین سلول‌های پوستی انسانی کراتینوسیت از دسته سلولی هاکات (Hacat) برای مطالعات پوستی در شرایط آزمایشگاهی برون‌تنی انتخاب می‌شوند. سلول‌های هاکات تجمعات سلولی را بعد از 7 روز نگهداری در گرم‌خانه (incubator) نشان می‌دهند. در مطالعه‌ای به منظور بررسی اثر نانوذرات، سلول‌های هاکات به مدت 7 روز به‌طور مستقیم در معرض نانوذرات قرار گرفته و بر اساس نوع نانوذره و غلظت آن، تعداد تجمعات سلولی و سطح آنها بررسی شده است [5].
در مطالعه‌ای دیگر، اثر نانوذرات طلا روی سلول‌های فیبروبلاست پوستی نشان داده شده است. در این مطالعه با تغییر غلظت نانوذرات در تماس با سلول‌های مذکور، ریخت‌شناسی (morphology) آن‌ها ارزیابی شده است؛ به‌گونه‌ای که با افزایـــش غلظت نانوذرات از mg/ml 0/1 به mg/ml 0/6، پایک‌های سلولی (اتصالات سلولی) به شدت باریک‌تر شده و در‌ نتیجه چسبندگی کمتری به سطح را نشان داده است؛ به‌علاوه تعداد سلول‌های رشد‌یافته نیز کاهش یافته که منجر به کاهش توانایی سلول‌ها در تکثیر سلولی شده است. شکل 3 تصاویر گرفته شده با لامپ جیوه از نانوذرات طلا در تماس با سلول‌های فیبروبلاست را نشان می‌دهد [6].

filereader.php?p1=main_eccbc87e4b5ce2fe2
شکل 3- تصاویر گرفته شده توسط لامپ جیوه از سلول‌های فیبروبلاست در حالت عدم حضور نانوذرات (کنترل)، حضور نانوذرات طلا با غلظت mg/ml 0/1 و غلظت mg/ml 0/6 [6].

2-2-1- بررسی میزان سلول‌های زنده/مرده
در مطالعه‌ای سلول‌های پوستــی اِچ‌دی‌اِف (HDF: Human Dermal Fibroblast) کشــت داده شده و سپــس به مدت 48 ساعت در معرض μg/ml 0/3 تا mg/ml 3 از نانوذرات قرار گرفته است. با استفاده از محلول‌های Calcein AM (0.5%) و Ethidiumhomodimer (2%) در محلول بافر فسفات میزان سلول‌های زنده تعیین شده است [4].

3-2-1- بررسی رهایش زی‌مایه LDH

لاکتات دِهیدروژناز (LDH) زی‌مایه‌ای از گروه اکسیدُرِداکتازهاست (oxidoreductase) که در بافت‌های بدن یافت می‌شود. به هنگام آسیب دیدن بافت‌ها، لاکتات دِهیدروژناز آزاد می‌شود؛ بنابراین از آن به عنوان معیاری برای شناسایی صدمات به سلول‌ها استفاده می‌شود. در مطالعه‌ای جهت بررسی میزان آسیب نانوذرات به سلول‌های فیبروبلاست، بعد از تماس دادن نانوذرات با سلول‌های پوستی HDF، در زمان‌های مشخص میزان زی‌مایه LDH اندازه‌گیری شده است [4].

4-2-1- بررسی فعالیت میتوکندری (آزمون MTT)

آزمون MTT یک روش آزمایشگاهی رنگ‌سنجی استاندارد برای اندازه‌گیری فعالیت زی‌مایه‌های میتوکندری سلول‌ها است. در سلول‌های زنده، ماده زرد رنگ MTT به بلورهای فُرمازان با رنگ بنفش تبدیل می‌شود. رسوب ایجاد شده در ایزوپروپانول حل شده و جذب این محلول رنگی در طول موج بین 500 تا 600 نانومتر توسط دستگاه طیف‌سنج نوری (spectrophotometer) اندازه‌گیری می‌شود. در مطالعه‌ای سلول‌های پوستی فیبروبلاست در پلیت (plate) 24 خانه قرار داده شده و مقادیر متفاوتی از نانوذرات از μg/ml 3 تا mg/ml 3 در تماس با آن‌ها قرار گرفته است، سپس با آزمونMTT و مقایسه آن با گروه کنترل آسیب وارده به سلول‌های فیبروبلاست تعیین شده است [4].

5-2-1- بررسی میزان تولید IL-8

زی‌مایه انسانی IL-8 یک زی‌مایه ایمنی برای ارزیابی میزان تولید واسطه‌های التهابی است؛ به‌طوری‌ که هر چه بافت در اثر التهاب آسیب بیشتری ببیند، میزان این زی‌مایه افزایش خواهد یافت. این آزمون از طریق کیت مخصوص آن و محلول‌های استاندارد انجام می‌شود [4].

6-2-1- بررسی نفوذپذیری نانوذرات به غشاهای پوستی

در یک توالی از آزمایش‌های بررسی نفوذ نانوذرات به بافت پوست، از غشاهای پوستی استفاده می‌شود؛ به‌این‌منظور از پوست‌های دور ریخته‌شده در حین جراحی‌ها استفاده می‌شود. قبل از منجمد کردن این پوست‌ها، چربی‌های زیر‌پوستی آن‌ها برداشته شده و موهای آن تراشیــده می‌شود. سپس این پوست‌ها در یخ‌زن (freezer) با دمای 25- C° نگهداری می‌شوند. زمان بهینه استفاده از این پوست‌ها حداکثر چهار ماه پس از منجمدسازی آن است. نتایج مطالعات نشان داده‌اند که این روش نگهداری آسیبی به پوست نمی‌رساند چرا که تفاوتی در نفوذپذیری پوست تازه و منجمد مشاهده نشده است. در مطالعه‌ای با استـــفاده از این غشاهای پوستی و بر مبنای روش فرانز (Franz Method)، نانوذرات با غلظت μg/cm 270 به صورت مخلوط شده با متانول 14% وزنی به نسبت 1 به 10 بر روی غشاها قرار گرفته و بعد از 24 ساعت غلظت نانوذرات اندازه‌گیری شده و از سطح غشاهای پوستــــی تصاویر میـــکروسکوپ الکتــــــرونی عبــــوری (TEM: Transmission Electron Microscope) تهیه شده است. با مشاهده تصاویر میزان نانوذرات وارد شده به غشاهای پوستی تشخیص داده شده است [7].

2- بحث و نتیجه‌گیری
ارزیابی خطر نانومواد در حیطه ایمنی، سلامت و بهداشت منجر به ایجاد بررسی‌های دقیق در این زمینه شده است. در حیطه سمّیت پوستی ناشی از نانومواد، محققان آزمایش‌های درون‌تنی و برون‌تنی را پیشنهاد کرده‌اند. بررسی شکل و اندازه سلول‌های پوستی و نوع چسبندگی آن‌ها، میزان رهایش زی‌مایه لاکتات‌دِهیدروژناز، میزان زی‌مایه اینترلوکین 8، میزان فعالیت میتوکندری، تعداد سلول‌های زنده و مرده و نفوذپذیری از غشاهای پوستی از روش‌های بررسی سمّیت نانوذرات در روش برون‌تنی است. همچنین در روش درون‌تنی، التهاب و حساسیت پوستی ناشی از حضور نانوذرات بر پوست حیوانات بررسی می‌شود.

منابـــع و مراجــــع

M. Crosera, M. Bovenzi, G. Maina, G. Adami, C. Zanette, C. Florio, et al., “Nanoparticle dermal absorption and toxicity: a review of the literature”, International Archives of Occupational and Environmental Health, Vol.82, I.9, p.1043–1055, (2009)

D.B. Warheit, R.A. Hoke, C. Finlay, E.M. Donner, K.L. Reed, C.M. Sayes, “Development of a base set of toxicity tests using ultrafine TiO2 particles as a component of nanoparticle risk management”, Toxicology Letters, Vol.171, I.3, p.99–110, (2007)

http://woundcare.persianblog.ir

C.M. Sayes, R. Wahi, P.A. Kurian, Y. Liu, J.L. West, K.D. Ausman, et al., “Correlating nanoscale titania structure with toxicity: a cytotoxicity and inflammatory response study with human dermal fibroblasts and human lung epithelial cells”, Toxicological Sciences, Vol.92, I.1, p.174–185, (2006)

E. Herzog, A. Casey, F.M. Lyng, G. Chambers, H.J. Byrne, M. Davoren, “A new approach to the toxicity testing of carbon-based nanomaterials—the clonogenic assay, Toxicology Letters, Vol.174, I.1–3, p.49–60, (2007).

N. Pernodet, X. Fang, Y. Sun, A. Bakhtina, A. Ramakrishnan, J. Sokolov, et al., “Adverse effects of citrate/gold nanoparticles on human dermal fibroblasts”, Small, Vol.2, I.6, p.766–773, (2006).

F.F. Larese, F. D’Agostin, M. Crosera, G. Adami, N. Renzi, M. Bovenzi, et al., “Human skin penetration of silver nanoparticles through intact and damaged skin”, Toxicology, Vol.255, I.2, p.33–37, (2009).